Dr. Thomas J. Magliery, Ohio State University

27. September 2011

Dr. Thomas J. Magliery

Thomas J. Magliery wurde 1974 in Oak Park, Illinois, geboren und wuchs außerhalb von Chicago und Indianapolis auf. Er forschte zusammen mit M. Ed Hodes am Indiana University Medical Center in Indianapolis auf dem Gebiet der medizinischen Genetik, was 1992 zu einem Projekt führte, das bei der Westinghouse Science Search als Halbfinalist ausgezeichnet wurde. Magliery studierte Chemie am Kenyon College in Gambier, Ohio, und erhielt seinen Ph.D. (2001) in Chemie von der University of California, Berkeley, unter der Leitung von Peter G. Schultz. Als NSF Pre-Doctoral Fellow arbeitete er an verschiedenen Schlüsselaspekten der Entwicklung lebender Bakterien für die ortsspezifische Einfügung unnatürlicher Aminosäuren. Als er 2001 zu Lynne ReganinMolecular Biophysics & Biochemistry an der Yale University stieß, führte Magliery ein zellbasiertes Screening für das Vier-Helix-Bündelprotein Rop ein und demonstrierte dessen Einsatz bei der Sortierung von Bibliotheken von Proteinvarianten mit randomisierten hydrophoben Kernen. Seit Herbst 2005 ist Magliery Assistenzprofessor an der Fakultät für Chemie und Biochemie der Ohio State University. Er ist Mitglied des Ohio State Biochemistry Program, des Biophysics Graduate Program und des Chemistry-Biology Interface Training Program.

Und so zeichnete ich buchstäblich auf einer Serviette eine Idee, wie man die Rop-Aktivität mit der GFP-Expression von einem Plasmid, das durch Rop reguliert wird, verbinden könnte. Ein paar Monate später hatten wir ein Bild von einer LB-Agar-Platte, die genau so aussah wie das Serviettenbild, und es war einer dieser Momente, in denen man erkennt, dass man hin und wieder tatsächlich ein Bild auf eine Serviette zeichnen kann und es sich als ein wirklich nützliches Experiment herausstellt. Ich meine, dieses Experiment allein ist die Grundlage für einen großen Teil der kombinatorischen Arbeit, die wir jetzt im Bereich der Proteinstabilität machen.

Interviewt von Barry Bunin, PhD, CEO, Collaborative Drug Discovery, Inc.

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Bearbeitetes Interview-Transkript

Barry Bunin
Ich dachte, eine interessante erste Frage wäre, da die meisten unserer Forscher an der Medikamentenentwicklung arbeiten, über Ihre Arbeit im Bereich des Screenings von Medikamenten im Vergleich zu Ihrer Arbeit im Bereich des Protein-Engineerings zu sprechen, in Bezug auf das, was Sie für jeden Bereich tun, was unterschiedlich ist, was ähnlich ist, wie sie sich gegenseitig ergänzen könnten?

Tom
Ich denke, dass wir uns bei unserer Arbeit im Rahmen des Wirkstoffscreenings hauptsächlich auf dieses Protein namens Paraoxonase 1 konzentriert haben, ein menschliches Serumprotein, das mit HDL-Cholesterin assoziiert ist und eine Hydrolase ist, allerdings mit einem unbekannten Ziel. Aber praktischerweise ist es, zumindest in geringem Maße, in der Lage, Organophosphorverbindungen zu hydrolysieren. Und so haben wir uns bemüht, das Protein zu modifizieren, um es zu einem realistischen Therapeutikum gegen Organophosphate, Pestizide und Nervenkampfstoffe zu machen, und das beinhaltet eine Reihe von verschiedenen Schritten. Ein Schritt ist, dass die Aktivität zu gering ist und dass wir nicht wirklich klar verstehen, wie wir die Spezifität ändern können, zumal wir nicht einmal wirklich genau wissen, wie der Mechanismus oder die aktive Seite des Proteins aussieht. Wir haben also mit Hilfe von Struktur-Aktivitäts-Beziehungen versucht, das zu verstehen, indem wir im Grunde genommen eine große Anzahl von Mutanten um das herum hergestellt haben, was wir für die aktive Seite halten, und sie gegen eine große Anzahl von Analoga sowohl von Estern als auch von Organophosphaten untersucht haben.

Aber diese Arbeit hat sich mit einigen der anderen Arbeiten im Labor verzahnt, denn der andere Aspekt dieses Programms war der Versuch, die Medikamentenverfügbarkeit zu verbessern, um es zu einem medikamentenähnlichen Molekül zu machen. Es ist wirklich schwierig, damit zu arbeiten, weil es normalerweise an diese fettigen HDL-Partikel gebunden ist, und so haben wir eine Reihe von Maßnahmen ergriffen, um das Protein löslicher und stabiler zu machen und einfach damit zu arbeiten, zum Beispiel durch die Entfernung von Cysteinen und ein Reengineering um sie herum. Wir tun auch einiges, um die Löslichkeit zu verbessern, während wir gleichzeitig versuchen, das eigentliche Medikament an der Oberfläche dem menschlichen Protein so ähnlich wie möglich zu machen, um immunologische Effekte zu vermeiden.

Der Grund für die Verzahnung mit den anderen Dingen, die wir tun, ist, dass der Schwerpunkt meines Labors auf einer Reihe verschiedener Ansätze liegt, um sowohl die Proteinstabilität als auch Proteininteraktionen zu verstehen. Wir haben eine Reihe von Methoden erfunden, um die Stabilität von Proteinbibliotheken zu screenen und dann im Hochdurchsatz quantitativ zu messen. Und wir haben auch Methoden entwickelt, um stabilisierende Mutationen aus Sequenzstatistiken vorherzusagen, zusätzlich zu einigen Dingen beim Verständnis von Proteininteraktionen mit ähnlichen Arten von Ansätzen. So konnten wir einige dieser grundlegenden Dinge, die wir gelernt haben, nutzen, um bessere Therapeutika zu entwickeln, die stabiler oder löslicher sind oder ähnliches. Es gibt also einige Themen, die sich durchziehen, wie z. B. die Verwendung von Hochdurchsatzansätzen und die Verwendung von Struktur-Aktivitäts-Beziehungen, aber die beiden unterschiedlichen Dinge haben sich wirklich gegenseitig sehr gut informiert.

Barry Bunin
Und wenn die Forschung mäßig erfolgreich oder extrem erfolgreich ist, was erwarten Sie als kurz- und langfristige Ergebnisse?

Tom
Nun, es kommt darauf an, um welchen Teil des Projekts es sich handelt, denn manches ist sehr grundlegend und manches ist sehr angewandt. Ich denke also, dass wir bereits eine Reihe von vorläufigen Erfolgen erzielt haben. Übrigens ist die Paraoxonase-Arbeit, die wir machen, Teil eines großen Zentrums, das von David Lenz am U.S. Army Medical Research Institute for Chemical Defense geleitet wird. Army Medical Research Institute for Chemical Defense (ICD) geleitet wird, und zu dem auch eine Gruppe am Weizmann-Institut gehört, insbesondere Danny Tawfik und Joel Sussman, die einen großen Teil des Activity Engineering gemacht haben, und dann auch Leute hier - Chris Hadad, der ein Computerchemiker ist, und George Wang, der an der Modifikation von Proteinen arbeitet, es ist also eine sehr große Gruppe von Leuten.

Aber ich denke, wir haben bereits einige wesentliche Fortschritte gemacht. Ich meine, wir waren in der Lage, zwischen dem Weizmann-Institut und uns und dem ICD, Varianten der Paraoxonase zu entwickeln, zu produzieren und im Tierversuch zu testen, die in der Lage sind, gegen tödliche Dosen von echten Nervenkampfstoffen zu schützen. Noch nicht alle, und sie sind vielleicht noch nicht genau das ideale Molekül, aber ich denke, schon das ist ein Erfolg. Ich denke also, wenn es sehr erfolgreich wäre, hätten wir entweder ein Molekül oder einen Cocktail von Molekülen, der in der Lage ist, ein breites Spektrum von Organophosphaten gegen hohe tödliche Dosen zu hydrolysieren, so dass sie wirklich komplett schützend sind. Aber wie ich schon sagte, auf dem Weg dorthin gibt es grundlegende Dinge zu lernen, die sich mit einigen der anderen Arbeiten, die wir machen, besser verzahnen lassen.

In Bezug auf die technischen Eigenschaften ist es unser langfristiges Ziel, zumindest empirisch, wenn nicht sogar grundlegend, besser vorhersagen zu können, welche Mutationen an Proteinen deren physikalische Eigenschaften verändern werden, insbesondere in Bezug auf Stabilität und Löslichkeit - Dinge, die derzeit sehr schwer zu berechnen sind und auch schwer zu meta-analysieren sind von einem Haufen verschiedener nicht verwandter Mutationen von Proteinen. Unsere Strategie besteht darin, hoffentlich große Mengen von hochgradig verwandten Mutationen zu erzeugen und ihre physikalischen Eigenschaften zu untersuchen, so dass wir eine Art statistisch signifikante Antwort auf Fragen wie diese erhalten können: Wie korrelieren Änderungen in der Sequenz von Proteinen und bestimmten Teilen der Proteine, z. B. im Kern oder in Schleifen oder auf der Oberfläche, wirklich mit Änderungen von Eigenschaften wie Stabilität und Löslichkeit, die sehr schwer vorherzusagen sind?

Barry Bunin
Sehr gut. Wie haben Sie CDD genutzt? Wo war CDD für Ihre Forschung in der Wissenschaft nützlich?

Tom
Ich denke, wir nutzen es in einem Bereich sehr viel und ich denke, wir haben angefangen, es in einem anderen Bereich zu nutzen. Um ehrlich zu sein, denke ich, dass wir mehr Zeit darauf verwenden müssen, aber ich denke, es hat großes Potenzial in diesem Bereich. Der erste Bereich ist also die Struktur-Aktivitäts-Beziehung mit Paraoxonase. Dieses Enzym und andere ähnliche Enzyme wie die Phosphotriesterase und einige andere Esterasen sind hervorragend in der Lage, OPs [phosphororganische Verbindungen] zumindest bis zu einem gewissen Grad umzuwandeln. Im Laufe der Jahre wurden viele Studien dazu durchgeführt, und so gibt es eine große Anzahl plausibler Substrate, einschließlich Nachahmungen von Nervenkampfstoffen, tatsächliche Nervenkampfstoffe, Pestizide, Nachahmungen von Pestiziden, Ester, Laktone - es gibt eine riesige Wissensbasis. Ich meine, abgesehen von den vielen Mutanten, die wir in unserem Labor hergestellt haben, gibt es bereits eine riesige Wissensbasis über verschiedene Mutationen.

Es ist eine große Herausforderung, all diese Daten zusammenzutragen und sie dann in tatsächliches Wissen umzuwandeln, und das ist eine wichtige Art und Weise, wie wir die Ressourcen von CDD nutzen: Wir können diese Daten so zusammenstellen, dass sie durchsuchbar sind und dass wir sie auf der Grundlage der Eigenschaften der verschiedenen Substrate organisieren und hoffentlich Schlussfolgerungen ziehen können, und ich glaube, dass das sehr fruchtbar war. Ich glaube, wir verstehen jetzt viel besser, welche Mutationen wichtig sind, z. B. für große oder kleine Substrate. Ich denke, dass die Möglichkeit, molekulare Eigenschaften zu berechnen und diese in CDD einfach zu sortieren, eine unschätzbare Ressource für uns darstellt.

Die andere Sache, die wir versucht haben, und die wir nicht so sehr erforscht haben, ist zu sehen, ob wir etwas Ähnliches mit den großen Bibliotheken von Proteinvarianten machen können, die wir erzeugen. Es ist natürlich möglich, sie einzubauen, einschließlich der Sequenzen und sogar der Strukturen, wenn wir das wollen. Im Prinzip können wir viel mehr einfache Berechnungen einbauen, denn bei vielen unserer Bibliotheken fangen wir so an: wie ist die Nettoladung an den Stellen, an denen wir Mutationen vorgenommen haben? wie ist die Hydrophobizität? und solche Dinge. Und wir haben das mit einer Kombination aus CDD und Excel gemacht, aber ich würde es gerne sehen, wenn wir Ihre Ressource [CDD] ein bisschen mehr dafür nutzen könnten. Vor allem, weil ich denke, dass es so einfacher ist, alle Ergebnisse zu organisieren. Ich bin jetzt das fünfte Jahr als Professor und habe eine Reihe von Studenten, die eine Reihe von Bibliotheken selbst für ein paar Modellproteine erstellen - wir untersuchen Tausende von Varianten dieser Proteine, und das wird zu einem organisatorischen Albtraum.

Barry Bunin
Großartig. Zurück zur Wissenschaft, denn ich weiß, dass Sie einen breiten Hintergrund in der Chemie und auch in der Biologie haben. Erzählen Sie einfach von einem "Aha"-Moment, der bei Ihnen für Ihre Karriere oder einfach aus Neugierde mitschwang, um Dinge zu erforschen und Sie in Ihrer Entwicklung als Wissenschaftler zu katapultieren.

Tom
Ja, absolut. Sie haben genau Recht, auch als Wissenschaftler selbst weiß man, dass es viele Tage gibt, an denen man einfach... Nun, lassen Sie es mich so sagen: Allein aus der Studienzeit habe ich sieben oder acht Notizbücher mit wahrscheinlich 30 veröffentlichungsfähigen Seiten darin. Es gibt viele, viele Tage, an denen man einfach nur versucht herauszufinden, wie die Dinge laufen, aber es gibt wirklich Wendepunkte in Ihrer Entwicklung, wenn Sie diese Momente haben, und ich denke, auf fast jeder Ebene habe ich solche Dinge erlebt.

Eine wirklich grundlegende Sache, die mich geprägt hat, als ich in der Wissenschaft anfing, war, dass ich ein Westinghouse-Projekt machte, als ich in der High School war und keine Ahnung hatte, was ich da tat. Ich schaute in ein Telefonbuch und rief Ed Hodes am Indiana University Medical Center an, ohne zu wissen, dass er ein Gigant der medizinischen Genetik und der Gentests war, und er ließ mich einfach sehr großzügig in sein Labor kommen, und ich arbeitete mit einem Post-Doc an einem Projekt über Einzelstamm-Konformations-Polymorphismus. Ich glaube, als wir das erste Gel visualisierten und ich in der Praxis wirklich erkannte, dass es als genetische Testmethode funktionieren würde, war das für mich extrem aufregend und ich glaube, diese Erfahrung war wirklich prägend. Aber ich glaube, ich hatte solche Erfahrungen auf fast jeder Ebene.

Eine andere war, als ich als Post-Doc bei Lynne Regan anfing. Lynne hatte lange Zeit gezielte Entwürfe dieses Proteins Rop gemacht, das ein Bündelprotein ist, an dem wir immer noch ziemlich viel arbeiten. Eines der Dinge, die sie nicht hatten, war eine Hochdurchsatzmethode, um die Funktion von Rop zu evaluieren. Und so zeichnete ich buchstäblich auf einer Serviette eine Idee, wie man die Rop-Aktivität mit der GFP-Expression von einem Plasmid, das von Rop reguliert wird, verbinden könnte. Ein paar Monate später hatten wir ein Bild von einer LB-Agar-Platte, die genau so aussah wie das Serviettenbild, und es war einer dieser Momente, in denen man erkennt, dass man ab und zu tatsächlich ein Bild auf eine Serviette zeichnen kann und es sich als ein wirklich nützliches Experiment herausstellt. Ich meine, dieses Experiment allein ist die Grundlage für einen großen Teil der kombinatorischen Arbeit, die wir jetzt im Bereich der Proteinstabilität machen, also denke ich, dass diese Dinge wirklich prägende und treibende Momente sind.

Barry Bunin
Dies könnte meine letzte Frage sein: Bevor Sie CDD verwendet haben, wie haben Sie Ihre Daten verwaltet und warum haben Sie sich ursprünglich für CDD entschieden?

Tom
Ich würde sagen, wir haben es ziemlich schlecht gemacht, ist wahrscheinlich die Antwort. Hauptsächlich mit Excel, und wir verwenden Excel immer noch für viele Dinge, weil es für viele Berechnungen sehr praktisch ist, aber das Ergebnis ist, dass unsere Daten in einem Haufen verschiedener Arbeitsblätter und Gruppenordner landen würden. Ich denke, dass die Analyse zwischen den Experimenten und zwischen den Projekten viel schwieriger war. Ganz zu schweigen von der Tatsache, dass man mit Nomenklaturproblemen konfrontiert wird, weil die Leute nicht unbedingt die Struktur des Moleküls in die Excel-Datenbank eingeben, also benennt man es einfach nach dem Zufallsprinzip, und wenn man dann zur Analyse zurückkehrt, muss man in der Lage sein, all diese Dinge zu entschlüsseln. Ich muss zugeben, dass ich mich nicht genau an den Moment erinnern kann, als ich zum ersten Mal von CDD hörte. Ich glaube, wir beide haben uns auf einer ACS-Tagung unterhalten, und dann habe ich es mir online angesehen und dachte: Das ist genau das, was wir brauchen, um Moleküle und dergleichen auf viel vernünftigere Weise katalogisieren zu können, Dinge, die wirklich über die einfachen Ressourcen von Excel hinausgehen. In gewisser Weise ist es sogar ein wenig seltsam, denn unsere Arbeit hat eine sehr bedeutende bioinformatische Komponente, und ich habe Studenten, die Perl und Java benutzen, aber wir hatten keine dieser Ressourcen für die Chemoinformatik eingesetzt. Das ist es, was CDD wirklich für uns getan hat, und es ist eine erstaunliche Schnittstelle für diese Arbeit.

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