Dr. Thomas J. Magliery, Universidad Estatal de Ohio

Thomas J. Magliery nació en Oak Park, Illinois, en 1974 y creció en las afueras de Chicago e Indianápolis. Llevó a cabo una investigación sobre genética médica con M. Ed Hodes en el Centro Médico de la Universidad de Indiana, en Indianápolis, que le llevó a ser semifinalista del concurso Westinghouse Science Search en 1992. Magliery se licenció en química en el Kenyon College de Gambier (Ohio) y recibió su Ph.D. (2001) en química por la Universidad de California, Berkeley, bajo la dirección de Peter G. Schultz. Como becario predoctoral de la NSF, trabajó en varios aspectos clave de la ingeniería de bacterias vivas para la inserción específica de aminoácidos no naturales. En 2001 se unió a Lynne Reganin, de Biofísica Molecular y Bioquímica, en la Universidad de Yale. Magliery introdujo un cribado basado en células para la proteína de cuatro hélices Rop y demostró su uso en la clasificación de bibliotecas de variantes de proteínas con núcleos hidrofóbicos aleatorios. Magliery se incorporó al cuerpo docente de la Universidad Estatal de Ohio en otoño de 2005 como profesor adjunto del Departamento de Química y del Departamento de Bioquímica. Es miembro del Programa de Bioquímica del Estado de Ohio, del Programa de Postgrado en Biofísica y del Programa de Formación de la Interfaz Química-Biología.

Así que, literalmente, dibujé en una servilleta una idea de cómo se podía vincular la actividad de Rop a la expresión de GFP de un plásmido regulado por Rop. Llegué allí, y unos meses más tarde teníamos una imagen de una placa de agar LB que era exactamente igual a esa imagen de la servilleta, y fue uno de esos momentos en los que te das cuenta de que de vez en cuando puedes dibujar una imagen en una servilleta y que resulte ser un experimento realmente útil. Quiero decir que ese experimento por sí solo es la base de una gran parte del trabajo combinatorio que hacemos ahora en la estabilidad de las proteínas.

Entrevistado por Barry Bunin, PhD, director general de Collaborative Drug Discovery, Inc.

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Transcripción editada de la entrevista

Barry Bunin
Creo que una primera pregunta interesante, dado que la mayoría de nuestros investigadores trabajan en el descubrimiento de fármacos, sería hablar de su trabajo de cribado para el descubrimiento de fármacos frente a algunos de los trabajos de ingeniería de proteínas que también ha realizado, en términos de lo que hace en cada área, lo que es diferente, lo que es similar, cómo podrían complementarse entre sí.

Tom
Creo que en cuanto al trabajo de cribado de descubrimiento de fármacos que estamos realizando, nos hemos centrado principalmente en esta proteína llamada paraoxonasa 1, que es una proteína de suero humano que está asociada al colesterol HDL y es una hidrolasa, pero de objetivo desconocido. Pero convenientemente, al menos en una tasa baja, es capaz de hidrolizar compuestos organofosforados. Así que nuestros esfuerzos han sido para modificar la proteína, para convertirla en una terapéutica realista contra los organofosforados, los pesticidas y los agentes nerviosos, y eso implica una serie de pasos diferentes. Uno de los pasos es que la actividad es demasiado baja y que no entendemos muy bien cómo cambiar la especificidad, sobre todo porque ni siquiera sabemos exactamente cómo es el mecanismo o el lado activo de la proteína. Así que hemos utilizado las relaciones estructura-actividad para tratar de entender eso, básicamente haciendo un gran número de mutantes alrededor de lo que creemos que es el sitio activo, y estudiándolo contra un gran número de análogos tanto de ésteres como de organofosforados.

Pero ese trabajo ha encajado con algunos de los otros trabajos en el laboratorio, porque el otro aspecto de este programa ha sido tratar de mejorar la farmacabilidad, para convertirla en una molécula más parecida a un fármaco. Es muy difícil trabajar con ella porque normalmente está unida a estas partículas grasientas de HDL, por lo que hemos hecho una serie de cosas para tratar de hacer que la proteína sea más soluble y estable y que sea fácil trabajar con ella, por ejemplo, eliminando las cisteínas y rediseñándolas. También estamos haciendo cosas para mejorar la solubilidad y, al mismo tiempo, intentar que el fármaco real sea lo más parecido posible a la proteína humana en la superficie, para evitar los efectos inmunológicos.

La razón por la que esto encaja con las otras cosas que estamos haciendo es que, en realidad, la mayor parte de mi laboratorio se centra en una serie de enfoques diferentes para entender tanto la estabilidad de las proteínas como sus interacciones. Hemos inventado una serie de métodos para buscar y medir cuantitativamente la estabilidad de las bibliotecas de proteínas. Y también hemos desarrollado métodos para poder predecir mutaciones estabilizadoras a partir de las estadísticas de la secuencia, además de algunas cosas con la comprensión de las interacciones de proteínas utilizando tipos de enfoques similares. Y así hemos podido tomar algunas de estas cosas fundamentales que hemos aprendido y aplicarlas para hacer mejores terapias que sean más estables o más solubles o cosas así. Hay algunos temas que se repiten, como el uso de enfoques de alto rendimiento y el uso de relaciones estructura-actividad, pero las dos cosas diferentes han sido capaces de informarse mutuamente en gran medida.

Barry Bunin
Y si la investigación tiene un éxito moderado o extremo, ¿cuáles cree que serán los resultados a corto y largo plazo?

Tom
Bueno, depende de qué parte del proyecto, porque algunas son muy fundamentales y otras muy aplicadas. Así que creo que ya hemos tenido varios éxitos preliminares. Y debo decir, por cierto, que el trabajo sobre la paraoxonasa que estamos realizando forma parte de una gran subvención del centro que dirige David Lenz en el Instituto de Investigación Médica del Ejército de Estados Unidos para la Defensa Química ( U.S. Army Medical Research Institute for Chemical Defense). El Instituto de Investigación Médica del Ejército para la Defensa Química (ICD ) incluye un grupo en el Instituto Weizmann, en particular Danny Tawfik y Joel Sussman, que han realizado gran parte de la ingeniería de la actividad, y también gente de aquí: Chris Hadad, que es un químico computacional, y George Wang, que trabaja en la modificación de proteínas, así que es un grupo muy grande de personas.

Pero creo que ya hemos hecho algunos progresos sustanciales. Quiero decir que hemos sido capaces, entre Weizmann y nosotros y el ICD, de diseñar, producir y probar en animales, variantes de paraoxonasa que son capaces de proteger contra dosis letales de auténticos agentes nerviosos. Todavía no todas, y puede que no sean exactamente la molécula ideal, pero creo que sólo eso es un éxito. Así que creo que si tuviera mucho éxito, tendríamos una molécula o un cóctel de moléculas que es capaz de hidrolizar un amplio espectro de organofosforados contra altas dosis letales, de modo que realmente son completamente protectoras. Pero, como he dicho, en el camino hay cosas fundamentales que aprender que encajan más con algunos de los otros trabajos que hacemos.

En cuanto a las propiedades de ingeniería, nuestro objetivo a largo plazo es ser capaces, al menos empíricamente, si no fundamentalmente, de predecir mejor qué mutaciones de las proteínas van a cambiar sus propiedades físicas, especialmente en términos de estabilidad y solubilidad - cosas que actualmente son muy difíciles de calcular y también han sido difíciles de meta-analizar a partir de un montón de diferentes mutaciones de proteínas no relacionadas. Nuestra estrategia consiste en generar grandes conjuntos de mutaciones altamente relacionadas y estudiar sus propiedades físicas, de modo que podamos obtener una especie de respuesta estadísticamente significativa a preguntas como: ¿Cómo se correlacionan los cambios en la secuencia de las proteínas y en partes concretas de las mismas, por ejemplo en el núcleo o en los bucles o en la superficie, con los cambios en propiedades como la estabilidad y la solubilidad, que son muy difíciles de predecir?

Barry Bunin
Muy bien. ¿Cómo ha utilizado CDD? ¿Dónde ha sido útil CDD para su investigación en la ciencia?

Tom
Creo que lo estamos utilizando mucho en un área y creo que hemos empezado a utilizarlo en otra. Para ser sincero, creo que tenemos que dedicarle más tiempo, pero creo que tiene un gran potencial en ese ámbito. El primer ámbito es el de las relaciones estructura-actividad con la paraoxonasa. Esta enzima y otras enzimas similares, como la fosfotriesterasa y un par de otras esterasas, son excelentes para transformar los OP [compuestos organofosforados] al menos hasta cierto punto. Se han realizado muchos estudios sobre ellas a lo largo de los años, por lo que hay un gran conjunto de sustratos plausibles, incluyendo imitaciones de agentes nerviosos, agentes nerviosos reales, plaguicidas, imitaciones de plaguicidas, ésteres, lactonas - hay una enorme base de conocimientos. Quiero decir, aparte de los muchos mutantes que hemos hecho en nuestro laboratorio, hay una enorme base de conocimientos que ya está ahí fuera de diferentes mutaciones.

Poder cotejar todos esos datos y convertirlos en conocimiento real es un reto muy importante, y esa es una forma importante en la que hemos estado utilizando los recursos de CDD : ser capaces de reunirlos de forma que se puedan buscar y organizar, basándonos en las propiedades de los diferentes sustratos, y esperamos poder sacar conclusiones, y de hecho creo que eso ha sido fructífero. Creo que ahora entendemos mucho mejor qué mutaciones son importantes para cosas como los sustratos grandes frente a los pequeños, por ejemplo. Creo que la capacidad de calcular las propiedades moleculares y de ordenarlas fácilmente en CDD hace que sea un recurso inestimable para nosotros.

La otra cosa que hemos intentado hacer y que no hemos explorado tanto, es ver si podemos hacer algo similar con las grandes bibliotecas de variantes de proteínas que generamos. Obviamente, es posible introducirlas, incluyendo las secuencias e incluso las estructuras, si queremos. En principio, podemos hacer muchos más cálculos sencillos, porque para muchas de nuestras bibliotecas es así como empezamos: por ejemplo, para los lugares donde hemos hecho mutaciones, ¿cuál es la carga neta? ¿cuál es la hidrofobicidad? y cosas así. Y hemos estado haciendo que con una combinación de CDD y Excel, pero me gustaría ver a ser capaz de utilizar su recurso [CDD] un poco más para eso. Principalmente porque creo que es más fácil organizar todos los resultados de esa manera. Y este es mi quinto año como profesor ahora, tener un grupo de estudiantes hacer un montón de bibliotecas de incluso sólo un par de proteínas modelo - estamos buscando en miles de variantes de estas proteínas, y por lo que sólo llega a ser una pesadilla de organización.

Barry Bunin
Muy bien. Volviendo a la ciencia, porque sé que tiene una amplia formación en química y biología. Háblenos de un momento "ah-ha", que le haya resonado para su carrera o simplemente por curiosidad, para explorar cosas y catapultarle en su desarrollo como científico.

Tom
Por supuesto. Tienes toda la razón, también como científico, sabes que hay muchos días en los que sólo... Bueno, déjame decirlo así: sólo de la escuela de posgrado, tengo siete u ocho cuadernos con probablemente 30 páginas publicables en ellos. Hay muchísimos días en los que sólo intentas averiguar cómo van las cosas, pero hay acontecimientos realmente decisivos en tu desarrollo, cuando tienes esos momentos, y creo que en casi todos los niveles me han ocurrido cosas así.

Una cosa realmente fundamental que me marcó cuando me inicié en la ciencia fue que hice un proyecto Westinghouse cuando estaba en el instituto y no tenía ni idea de lo que estaba haciendo. Busqué en la guía telefónica y llamé a Ed Hodes en el Centro Médico de la Universidad de Indiana, sin saber que era un gigante de la genética médica y de las pruebas genéticas, y él, muy generosamente, me hizo ir a su laboratorio, y yo estaba trabajando con un postdoctorado en un proyecto sobre polimorfismo de conformación de una sola cepa. Creo que cuando visualizamos ese primer gel, y me di cuenta en la práctica de que iba a funcionar como método de prueba genética, eso fue extremadamente emocionante para mí y creo que esa experiencia fue realmente formativa. Pero creo que tuve experiencias como esa en casi todos los niveles.

Otra fue cuando empecé como post doc con Lynne Regan. Lynne llevaba mucho tiempo haciendo diseños dirigidos de esta proteína Rop, que es una proteína del paquete en la que todavía trabajamos bastante. Una de las cosas que no tenían era una forma de alto rendimiento para evaluar la función de Rop. Así que, literalmente, dibujé en una servilleta una idea de cómo se podía vincular la actividad de Rop a la expresión de GFP a partir de un plásmido regulado por Rop. Lo conseguí, y unos meses más tarde teníamos una imagen de una placa de agar LB que era exactamente igual a esa imagen de la servilleta, y fue uno de esos momentos en los que te das cuenta de que, de vez en cuando, puedes dibujar una imagen en una servilleta y que resulte ser un experimento realmente útil. Quiero decir que ese experimento por sí solo es la base de una gran parte del trabajo combinatorio que hacemos ahora en la estabilidad de las proteínas, así que creo que esas cosas son realmente formativas y momentos de impulso.

Barry Bunin
Esta puede ser mi última pregunta: Antes de utilizar CDD, ¿cómo gestionaba sus datos y por qué eligió inicialmente CDD?

Tom
Yo diría que lo hicimos bastante mal, es probablemente la respuesta. Principalmente con Excel, y todavía usamos Excel para muchas cosas porque es muy cómodo para muchos cálculos, pero el resultado es que nuestros datos acababan en un montón de hojas de trabajo diferentes y en las carpetas de archivos de los grupos. Creo que el análisis entre experimentos y entre proyectos era mucho más difícil. Por no hablar del hecho de que acabas teniendo problemas de nomenclatura, porque la gente no va a introducir necesariamente la estructura de la molécula en tu base de datos de Excel, así que simplemente la nombras de una manera aleatoria y luego, cuando vuelves a analizar, tienes que ser capaz de decodificar todas esas cosas. En realidad tengo que decir que no estoy exactamente seguro de recordar el momento en que oí hablar por primera vez de CDD. Creo que tal vez tú y yo hablamos en una reunión de la AEC y luego volví a mirarlo en Internet y pensé: Esto es exactamente lo que necesitamos para poder catalogar moléculas y cosas así de una manera mucho más razonable, cosas que realmente están más allá de los simples recursos de Excel. En cierto modo, es un poco extraño, porque lo que hacemos tiene un componente bioinformático muy importante, y tengo estudiantes que utilizan Perl y Java, pero no habíamos utilizado ninguno de esos recursos en el ámbito de la quimioinformática. Eso es lo que CDD ha hecho realmente por nosotros, y es una interfaz increíble para eso.

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